TUNEL实验操作中的细节
由于TUNEL操作步骤多，在实验操作中往往由于细节上的疏忽使实验失败。总结多年操作经验，我们认为应注意以下问题。
1. 阳性对照
实验前应选择好阳性对照切片。一般试剂公司会提供1—2张阳性对照，如果没有可以选择凋亡细胞比较多的有生发中心的淋巴结作为阳性对照。这一点非常重要，它是评价所有操作过程的准确性和可靠性的阳性标准。
2. 阴性对照
阴性对照是实验标本不加末端转移酶(TDT)进行温箱孵育，这是控制结果质量的重要参照。
3. DNA的暴露
由于DNA在细胞核内，必须经过一定的处理才能暴露出来。
目前已知暴露DNA的方法有多种，如：枸橼酸盐的微波修复、高压修复、蛋白酶k的消化等。
至于选择哪种方式，应该按照说明书的操作规程来做，因为生产商在产品出厂之前会对该产品进行测试，一般认为说明书所写暴露方法为最佳方法。
我们不能为追求高阳性率而改变操作方式，即使是按说明书上的操作程序进行，但有些条件也需要操作者在实践中摸索。例如蛋白酶k的消化时间和浓度，不同的组织以及组织的新旧都会影响其作用效果。
4. 操作中切片的干燥与湿润
目前的TUNEL试剂盒大都有两种显色方法，即可用荧光显微镜观察，也可在DAB显色后使用普通生物显微镜观察，试剂盒往往注明这两种方法都能得到很好的结果。
如果使用荧光显微镜观察，在滴加TUNEL反应液(TDT液)和标记辣根过氧化物酶(HＲP)的荧光素抗体前，必须保持切片干燥，这样能使荧光素牢固地与TDT结合，荧光强度最佳。
如果使用普通的生物显微镜观察则恰好相反，实验中必须保持切片的湿润，如果在滴加TUNEL反应液(TDT液)和标记HＲP的荧光素抗体前切片干燥，会产生严重的背景色，影响观察。因此，实验者应根据需求采用最佳方法。
5. 反应液
适当延长 TUNEL 反应液的时间，一般是37ºC 1 h，也可以根据细胞凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至 2 h，但要结合你最终的背景着色。
6. 显色时间
应严格观察阳性对照和阴性对照组细胞核的显色时间，一旦阳性对照组细胞核显现出棕黄色应立即停止，如果阴性对照组有背景显色，则提示显色过度，可能出现假阳性结果。
高质量的阳性结果是高倍镜下细胞核被染成棕黄色，而细胞的其他成分不显色。至于是否对切片进行套染，这并不重要，如需套染则主张应用甲基绿或苏木素。
7. 脱蜡水化
Tunel检测需充分脱蜡水化，脱蜡可以先 60ºC 20 min，再使用二甲苯两次 5-10 min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀。
8. 孵育
一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用 10-30 min，几 μm 切片用短时间；几十 μm 切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。实验结果出现的假阳性也可能与Tunel染色孵育步骤有关，Tunel染色液孵育时间过长，可能会出现非特异性荧光。
提倡用37℃的温箱进行孵育，孵育过程中要使用盖玻片、塑料薄膜等覆盖，防止孵育液的挥发。
9. 操作细节
① 避光操作：荧光在普通光照下不能长时间保持荧光，所以，在进行需要避光操作的步骤时，我们要严格进行避光操作，避免荧光淬灭导致不能对实验结果有准确判断。
② 轻柔操作：贴壁细胞在加药诱导凋亡后，细胞状态会发生改变，细胞形态皱缩边缘，其贴壁粘附力降低。在对此细胞进行实验染色时，需要小心操作，避免吹打造成的细胞脱落，尤其是我们在对细胞的多次洗涤时操作更要小心轻柔。
③ 曝光：在进行荧光显微镜观察时，根据显微镜的不同，具体参数曝光时间建议在1000ms以内，增益参数建议在500%以内，或不开增益曝光时间控制在2000ms以内，过度曝光也会增加实验的假阳性。
10. 阳性结果的判断
这是实验的最后一步，也是最关键的一步。
在TUNEL染色中凋亡细胞核为棕黄色，单个细胞或散在存在，多存在于坏死与正常组织的交界处，在坏死的组织中凋亡细胞反而少见。背景为无色或复染后的绿色或蓝紫色。